Toxizitätsprüfung und chemische Kanzerogene
Wie ein neuer Wirkstoff vor der Erstanwendung am Menschen toxikologisch geprüft wird: allgemeine Toxizität, Genotoxizität, Kanzerogenität und Reproduktionstoxizität, dazu die wichtigsten chemischen Kanzerogene und ihre metabolische Aktivierung.
Dein roter Faden
- Ziel: Die präklinische Toxizitätsprüfung sucht Zielorgane, Dosis-Wirkungs-Beziehung und Reversibilität und begründet damit die Startdosis der Erstanwendung am Menschen.
- Allgemein vs. speziell: Allgemeine Toxizität (akut, subakut, subchronisch, chronisch) in zwei Spezies, speziell dazu Genotoxizität, Kanzerogenität, Reproduktionstoxizität und lokale Verträglichkeit.
- Genotoxizität: Standardbatterie aus Ames-Test, In-vitro-Säugerzelltest und In-vivo-Mikrokerntest, weil kein Einzeltest Punktmutation, Klastogenität und Aneugenität zugleich erfasst.
- Ames-Test: Rückmutation histidinauxotropher Salmonellen, immer mit und ohne S9-Mix, da Bakterien kein CYP-System haben und Prokanzerogene sonst übersehen werden.
- Kanzerogene: genotoxische binden kovalent an DNA (keine Schwelle), nicht-genotoxische wirken indirekt über Proliferationsreiz oder Hormone (Schwelle ableitbar).
- Giftung: Benzo[a]pyren, Aflatoxin B1, Nitrosamine und aromatische Amine werden erst durch CYP-Enzyme zu elektrophilen DNA-Addukt-Bildnern.
- Grenzen und 3R: Speziesunterschiede im Metabolismus und idiosynkratische Reaktionen limitieren die Übertragbarkeit; Replace, Reduce, Refine mit Organoiden und QSAR ersetzen zunehmend Tierversuche.
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Ziel und Rahmen
Die präklinische Toxizitätsprüfung klärt vor der Erstanwendung am Menschen, welche Organe ein Stoff schädigt, ab welcher Exposition das geschieht und ob der Schaden reversibel ist. Sie liefert damit die Begründung für die Startdosis und die Parameter, die man in der klinischen Prüfung überwacht.
- Zweck: Zielorgane, Dosis-Wirkungs-Beziehung und Reversibilität der Schäden bestimmen, nicht die Wirksamkeit.
- Einordnung: Teil der Präklinik, parallel zu Pharmakologie und Kinetik, vor der klinischen Prüfung; Ablauf und Sicherheitspharmakologie siehe Arzneimittelentwicklung.
- Rahmen: harmonisierte ICH-Leitlinien legen Umfang und Zeitpunkt fest, die Studien laufen unter Guter Laborpraxis (GLP), also nachvollziehbar und archiviert.
- Übertragbarkeit: meist eine Nager- und eine Nicht-Nager-Spezies, weil Metabolismus und Empfindlichkeit speziesabhängig sind; ein humaner Metabolit, der im Tier nicht entsteht, bleibt sonst ungeprüft.
Grenzen bleiben: idiosynkratische und immunologisch vermittelte Reaktionen beim Menschen lassen sich im Tier kaum vorhersagen.
Allgemeine Toxizität
Die allgemeine Toxizität prüft unspezifisch alle Organsysteme über Klinik, Labor, Organgewichte und Histopathologie. Entscheidend ist die Dauer der Gabe: Sie muss zur geplanten Anwendungsdauer am Menschen passen.
| Studientyp | Dauer der Gabe | Fragestellung |
|---|---|---|
| Akute Toxizität | Einmalgabe | grobe Dosisfindung, akute Symptomatik; Letalität wird heute vermieden |
| Subakut | Wochen | erste Zielorgane, Dosisstufen für die Folgestudien |
| Subchronisch | wenige Monate | Zielorgane, Reversibilität nach Auswaschphase |
| Chronisch | bis Monate bis Jahre | Spättoxizität, Kumulation, Grundlage für Dauertherapie |
- Dosisstufen: mindestens drei, die höchste soll klare, aber nicht letale Toxizität zeigen, die niedrigste keinen Effekt.
- Ableitung: aus der niedrigsten Spezies-NOAEL wird über Körperoberflächen-Umrechnung und einen Sicherheitsfaktor die Startdosis der Erstanwendung am Menschen begründet (Kenngrößen siehe Grundbegriffe).
Genotoxizität
Genotoxizität ist jede Schädigung des Erbmaterials, also auch DNA-Addukte, Strangbrüche oder Spindelstörungen. Mutagenität ist der engere Begriff: eine vererbbare Veränderung der DNA-Sequenz oder der Chromosomenzahl. Geprüft wird in einer Standardbatterie, weil kein Einzeltest alle Schadensarten erfasst.
- Ames-Test: Rückmutationstest an auxotrophen Salmonella-typhimurium-Stämmen, die ohne Histidin nicht wachsen; eine Rückmutation stellt die Histidin-Synthese wieder her, gezählt werden die Revertantenkolonien.
- Metabolische Aktivierung: Parallelansatz mit S9-Mix, dem postmitochondrialen Leberüberstand enzyminduzierter Ratten plus NADPH-regenerierendem System, weil Bakterien kein CYP-System besitzen.
- In-vitro-Säugerzelltest: Chromosomenaberrationstest oder Mikrokerntest an Zellkulturen erfasst klastogene (bruchauslösende) und aneugene (spindelstörende) Effekte.
- In-vivo-Bestätigung: Mikrokerntest an polychromatischen Erythrozyten des Knochenmarks; Mikrokerne sind Nebenkerne aus Chromosomenfragmenten oder ganzen Chromosomen, die bei der Zellteilung zurückbleiben.
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Viele Kanzerogene sind Prokanzerogene und werden erst durch Cytochrom-P450-Enzyme zu elektrophilen, DNA-bindenden Metaboliten gegiftet. Bakterien haben diesen Fremdstoffmetabolismus nicht, deshalb liefert der Ansatz ohne Aktivierung bei Stoffen wie Benzo[a]pyren oder Aflatoxin B1 ein falsch negatives Ergebnis. Der S9-Mix simuliert die Leberphase I. Umgekehrt kann ein Stoff auch nur ohne S9 positiv sein, wenn die Leber ihn entgiftet.
Kanzerogenität und Reproduktionstoxizität
Diese speziellen Prüfungen folgen erst, wenn eine lange Anwendung oder eine betroffene Patientengruppe es verlangt. Sie sind aufwendig und werden gezielt eingesetzt.
- Kanzerogenitätsstudie: lebenslange Gabe an zwei Nagerspezies über etwa zwei Jahre, gefordert bei Daueranwendung über mehrere Monate oder bei Verdachtsmomenten aus Genotoxizität und Histopathologie.
- Entscheidungshilfe: ein positiver Befund der Genotoxizitätsbatterie macht die Entwicklung eines Nicht-Onkologikums meist unmöglich; das Mehrstufenmodell der Tumorentstehung erklärt, warum eine einzige Mutation genügen kann.
- Reproduktionstoxizität: drei Segmente, nämlich Fertilität und frühe Embryonalentwicklung, embryofetale Entwicklung in zwei Spezies (Teratogenitätsprüfung in der Organogenese) sowie peri- und postnatale Entwicklung bis zur nächsten Generation.
- Lokale Verträglichkeit und Sensibilisierung: Prüfung am Applikationsort je nach Arzneiform, dazu Hautsensibilisierung heute weitgehend mit Zelltests statt am Tier.
Wie die Ergebnisse in die Beratung zu Schwangerschaft und Stillzeit übersetzt werden, steht dort.
Alternativen zum Tierversuch
Tierversuche sind rechtlich nur zulässig, wenn kein gleichwertiges Verfahren existiert; die Entwicklung von Ersatzmethoden ist entsprechend weit fortgeschritten.
Replace (Tierversuch durch ein anderes Verfahren ersetzen), Reduce (Tierzahl durch besseres Studiendesign und Statistik senken), Refine (Belastung der Tiere mindern, etwa durch humane Endpunkte statt Letalität).
- In vitro: primäre Hepatozyten und Lebersphäroide für Metabolismus und Lebertoxizität, Organoide und Mehrorgan-Chips, Hautmodelle für lokale Verträglichkeit und Sensibilisierung.
- In silico: QSAR- und Expertensysteme sagen aus Strukturmerkmalen (Strukturalerts) mutagenes Potenzial voraus, Standard bei der Bewertung genotoxischer Verunreinigungen wie Nitrosaminen.
- Grenze: systemische Kinetik, Verteilung und Organinteraktionen bildet bisher kein In-vitro-System vollständig ab.
Chemische Kanzerogene
Chemische Kanzerogene teilt man nach ihrem Wirkprinzip ein, und daraus folgt direkt die Frage nach einem Schwellenwert.
- Genotoxische Kanzerogene: binden kovalent an DNA und erzeugen Addukte oder Strangbrüche; da theoretisch ein einziges Molekül eine Mutation setzen kann, geht man von keiner Wirkschwelle aus (Beispiel: Alkylanzien).
- Nicht-genotoxische Kanzerogene: wirken indirekt über chronische Zytotoxizität mit Regenerationsreiz, hormonelle Stimulation oder Enzyminduktion; hier gilt eine Schwelle, ein NOAEL ist ableitbar.
- Prokanzerogen: ein an sich inaktiver Stoff, der erst durch Fremdstoffmetabolismus (Giftung) zum elektrophilen, DNA-bindenden ultimalen Kanzerogen wird.
![Reaktionsschema von Benzo[a]pyren über Epoxid und Diol zum Diolepoxid mit Addukt an Guanin](img/abb-03.svg)
| Leitbeispiel | Aktivierung | Typisches Zielorgan |
|---|---|---|
| Benzo[a]pyren (polyzyklische Aromaten) | CYP1A1 → Diolepoxid, bindet an N2-Guanin | Lunge, Haut |
| Aflatoxin B1 | CYP3A4 → 8,9-Epoxid, Addukt an N7-Guanin | Leber |
| Nitrosamine | CYP2E1, α-Hydroxylierung → Alkyldiazoniumion → O6-Alkylguanin | Leber, Ösophagus |
| Aromatische Amine | CYP1A2 N-Hydroxylierung, dann Konjugation → Nitreniumion | Harnblase |
Fast alle klassischen chemischen Kanzerogene sind Prokanzerogene: Nicht der Stoff selbst, sondern sein elektrophiler Metabolit alkyliert die DNA.
Für genotoxische Verunreinigungen in Arzneimitteln arbeitet man deshalb nicht mit einer Schwelle, sondern mit einer toxikologisch vertretbaren Aufnahmemenge, die ein als vernachlässigbar bewertetes Zusatzrisiko ergibt.
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Reihenfolge
Warum?
Aussage 4
Studien zur allgemeinen Toxizität werden in der Regel in einer Nager- und einer Nicht-Nager-Spezies durchgeführt.
Zwei Spezies, weil Metabolismus und Empfindlichkeit speziesabhängig sind und ein relevanter Metabolit in nur einer Spezies entstehen kann.
Aussage 5
Für genotoxische Kanzerogene nimmt man grundsätzlich eine Wirkschwelle an, unterhalb derer kein Risiko besteht.
Falsch. Da schon ein einziges DNA-Addukt eine Mutation setzen kann, geht man bei genotoxischen Kanzerogenen von keiner Schwelle aus. Eine Schwelle und damit ein NOAEL ist nur für nicht-genotoxische Kanzerogene ableitbar.
Aussage 6
Der Mikrokerntest weist Punktmutationen in Bakterien nach.
Falsch. Der Mikrokerntest erfasst Chromosomenfragmente und ganze Chromosomen in Nebenkernen von Säugerzellen, also klastogene und aneugene Effekte. Punktmutationen in Bakterien prüft der Ames-Test.
Aussage 7
Der S9-Mix im Ames-Test besteht aus einem postmitochondrialen Leberüberstand und soll den Fremdstoffmetabolismus nachbilden.
Bakterien besitzen kein Cytochrom-P450-System. Der S9-Mix mit NADPH-regenerierendem System liefert die Phase-I-Enzyme, damit Prokanzerogene gegiftet werden.
Aussage 8
Benzo[a]pyren wird durch CYP-Enzyme zum Diolepoxid aktiviert, das kovalent an Guanin bindet.
Benzo[a]pyren ist ein Prokanzerogen. Erst der elektrophile Diolepoxid-Metabolit bildet das DNA-Addukt an N2-Guanin.
Lückentext
Aussage 10
Das 3R-Prinzip steht für Replace, Reduce und Refine.
Ersatz des Tierversuchs, Verringerung der Tierzahl und Verminderung der Belastung, etwa durch humane Endpunkte statt Letalität.
Prüferin fragt
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